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蛋白酶K的活性检测方法分析
点击次数:779 发布时间:2018-04-24
   蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶,因此可以用苯甲基磺酰氟抑制其作用,苯甲基磺酰氟是一种丝氨酸蛋白酶的抑制剂。值得注意的是,蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理,它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用,以增加探针与靶核酸结合的机会,提高杂交信号.但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时,都会对细胞的结构有一定的破坏,导致组织切片的脱落,细胞核的消失,从而影响杂交结果.EDTA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用,解决上述出现的问题,并能达到理想的染色效果。
  蛋白酶K的活性检测方法分析:
  蛋白酶K在一定的温度与PH条件下,水解酪素底物,然后加入三氯乙酸终止酶反应,并使未水解的酪素沉淀除去,滤液对紫外光有吸收,可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。
  分析步骤:
  1.求K值
  按要求配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液,然后,直接用紫外分光光度计测定其吸光度(A),并计算K值(其K值应在130~135范围内)。
  2.待测酶液的制备
  ①称取酶粉1~2g,精确至0.0002g(或吸取酶液1.00 mL);
  ②测定酶粉稀释。
  3.测定
  除酶液吸取2.00mL、酪素吸取2.00mL、三氯乙酸吸取4.00 mL外,其它操作条件同福林法测定反应、静止沉淀,直到过滤。滤液用紫外分光光度计,在275nm波长下,用10mm比色皿,测定其吸光度(A)。
  5计算
  X=A×K×8/2×1/10×n=2/5×A×K×n×E;
  式中:
  X—样品的酶活力,u/g(u/mL);
  A—试样溶液的平均吸光度;
  K—吸光常数;
  8—反应试剂的总体积,mL;
  2—吸取酶液2.00mL,以1min计;
  1/10—反应时间10min,以1min计;
  n—稀释倍数;
  E—紫外法与福林法的换算系数。
  6.结果的允许差
  平行试验测定值之差不得超过3%。

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